用于在植物中增强种子特异性基因表达而促进增强的多不饱和脂肪酸合成的调节性核酸分子的制作方法

  本发明原则上涉及脂肪酸的重组生产领域。本发明提供了新核酸分子,其包含编码脂肪酸去饱和酶、延伸酶、酰基转移酶的核酸序列、与所述核酸序列有效连接的终止子序列和高表达的种子特异性启动子,其中增强核酸表达的核酸(NEENA)与所述启动子功能性连接。本发明还提供了含有所述核酸分子的重组表达载体、已经导入该表达载体的宿主细胞或宿主细胞培养物,和用于大规模生产长链多不饱和脂肪酸(LCPUFAs)例如花生四烯酸(ARA)、二十碳五烯酸(EPA)或二十二碳六烯酸(DHA)的方法。发明描述转基因在植物中的表达强烈地受多种外部及内部因素影响,从而导致变动和不可预测水平的转基因表达。经常不得不产生大量的转化体并进行分析,以鉴定具有合乎需要的表达强度的株系。由于转化并筛选表达强度合乎需要的株系是昂贵和耗费人力的,故需要一个或多个转基因在植物中高表达。当不得不在转基因植物中协调表达几个基因以实现特定效应时,鉴于必须鉴定其中每个基因均强烈表达的植物,这个问题尤其突出。例如,取决于构建体设计和各个转化事件中T-DNA插入基因座的位置效应,转基因的表达可以显著地变动。强启动子可以部分地克服这些难题。然而,显示强烈表达同时特异性合乎需要的合适启动子的可获得性经常有限。为了确保可获得具有合乎需要的表达特异性的充足启动子,额外启动子的鉴定和表征可能有助于弥合这种缺口。然而,具有相应特异性和强度的启动子的天然可获得性和费时的候选启动子表征阻碍了合适的新启动子的鉴定。为了克服这些难题,已经显示多样的遗传元件和/或基序积极地影响基因表达。在它们当中,已经认可一些内含子作为具有改善基因表达的强大潜能的遗传元件。虽然机制大多未知,但是已经显示一些内含子积极地影响成熟mRNA的稳态量,这可能通过增强的转录活性、改善的mRNA成熟、增强的胞核mRNA输出和/或改善的翻译起始来影响(例如Huang和Gorman,1990;LeHir等人,2003;Nott等人,2004)。由于显示仅所选的内含子增加表达,故剪接本身很可能解释不了观察到的效果。将内含子与启动子功能性连接时观察到的基因表达增加称作内含子介导的基因表达增强(IME)并且已经在多种单子叶植物(例如Callis等人,1987;Vasil等人,1989;Bruce等人,1990;Lu等人,2008)和双子叶植物(例如Chung等人,2006;Kim等人,2006;Rose等人,2008)得到显示。在这个方面,显示内含子相对于翻译起始位点(ATG)的位置对于内含子介导的基因表达增强至关重要(Rose等人,2004)。继内含子增强基因表达的潜能之后,显示为数不多的内含子还在植物中于其原有核苷酸环境下影响组织特异性。发现报道基因表达依赖于含有多达2个内含子的基因组区域的存在(Sieburth等人,1997;Wang等人,2004)。也已经报道5’UTR内含子对启动子元件的恰当功能性是重要的,这可能归因于内含子中存在的组织特异性基因控制元件(Fu等人,1995a;Fu等人,1995b;Vitale等人,2003;Kim等人,2006)。然而,这些研究还显示内含子与异源启动子的组合可以对基因表达的强度和/或特异性产生强烈的不利影响(Vitale等人,2003;Kim等人,2006;WO2006/003186、WO2007/098042)。例如,组成型花椰菜花叶病毒CaMV35S强启动子因与芝麻SeFAD25’UTR内含子组合而不利地影响表达(Kim等人,2006)。与这些观察结果相反,一些文献显示通过IME增强核酸的表达而不影响相应启动子的组织特异性(Schünemann等人,2004)。本领域中尚未显示与异源启动子功能性连接时增强种子特异性表达的内含子或NEENA。在本申请中,描述了与种子特异性启动子功能性连接时增强所述启动子的表达同时不影响其特异性的其他核酸分子。在本申请中将这些核酸分子描述为“增强核酸表达的核酸”(NEENA)。内含子具有从各自的前mRNA剪接下来的内在特征。与其相反,本申请中即将陈述的核酸不必要一定包含于mRNA中,或如果存在于mRNA中,没有必要一定从mRNA中剪接下来,以增强源自与NEENA功能性连接的启动子的表达。发明详述本发明的第一实施方案涉及促进多不饱和脂肪酸合成增强的多核苷酸,因此它通常涉及多不饱和脂肪酸的重组生产。脂肪酸是具有在众多生物学过程中发挥基础作用的长链烃侧基团的羧酸。脂肪酸在自然界中罕以游离形式存在,相反,以酯化形式作为脂类的主要组分出现。因此,脂类/脂肪酸是能量的来源(例如,β-氧化)。此外,脂类/脂肪酸是细胞膜的不可分割部分,并且因此对处理生物学或生物化学信息是必不可少的。脂肪酸可以分成两类:由碳单键形成的饱和脂肪酸和含有一个或多个处于顺式构型的碳双键的不饱和脂肪酸。不饱和脂肪酸由属于非血红素-铁酶类型的末端去饱和酶产生。这些酶的每一种均是包括1种或2种其他蛋白质即细胞色素b5和NADH-细胞色素b5还原酶的电子传递系统的部分。细胞色素b5功能性也可以N端地与一种单一蛋白的去饱和酶部分融合。具体而言,此类酶催化脂肪酸分子的碳原子间双键的形成,例如,通过催化脂肪酸的氧依赖性脱氢(Sperling等人,2003)。人和其他哺乳动物具有有限范围的为形成不饱和脂肪酸中特定双键所需要的去饱和酶并且因而具有合成必需脂肪酸(例如,长链多不饱和脂肪酸(LCPUFA))的有限能力。因而,人们不得不通过其膳食摄取某些脂肪酸。此类必需脂肪酸包括例如亚油酸(C18:2)、亚麻酸(C18:3)。相反,昆虫、微生物和植物能够合成种类多得多的不饱和脂肪酸及它们的衍生物。实际上,脂肪酸的生物合成是植物和微生物的一项主要活动。长链多不饱和脂肪酸(LCPUFA)如二十二碳六烯酸(DHA,22:6(4,7,10,13,16,19))是哺乳动物中多种组织和细胞器(神经、视网膜、脑和免疫细胞)的细胞膜的必需组分。例如,脑磷脂中超过30%的脂肪酸是22:6(n-3)和20:4(n-6)(Crawford,M.A.,等人,(1997)Am.J.Clin.Nutr.66:1032S-1041S)。在视网膜中,DHA占据视杆外区(光受体细胞的光敏部分)多于60%的总脂肪酸(Giusto,N.M.,等人(2000)Prog.LipidRes.39:315-391)。临床研究已经显示,DHA对婴儿中脑的生长和发育和中正常脑功能的维持是重要的(Martinetz,M.(1992)J.Pediatr.120:S129-S138)。DHA还显著地影响参与信号转导过程的光受体功能、视紫红质激活和视杆与视锥发育(Giusto,N.M.,等人(2000)Prog.LipidRes.39:315-391)。此外,还发现DHA对疾病如高血压、关节炎、动脉粥样硬化、抑郁、血栓形成和癌症的某些积极影响(Horrocks,L.A.和Yeo,Y.K.(1999)Pharmacol.Res.40:211-215)。因此,脂肪酸的适宜膳食对人健康是重要的。因为此类脂肪酸不能被婴儿、幼儿和老年人有效合成,故从膳食中充分摄取这些脂肪酸对于这些个体是特别重要的(Spector,A.A.(1999)Lipids34:S1-S3)。目前,DHA的主要来源是来自鱼类和藻类的油。鱼油是这种脂肪酸的主要和传统来源,然而,它通常因销售它的时间被氧化。此外,鱼油的供给量是高度不定的,尤其鉴于鱼群正在缩减。另外,油的藻类来源因低产量和高提取成本而是昂贵的。EPA和ARA二者均是Δ5必需脂肪酸。它们形和动物的独特类型的食品和饲料组分。EPA属于酰基链中具有5个双键的n-3系列。EPA存在于海鲜中并且在来自北大西洋的多油鱼类中丰富。ARA属于具有4个双键的n-6系列。与EPA中存在的那些性能相比,在ω-3位置缺少双键赋予ARA不同的性能。从ARA产生的类花生酸类具有强烈的炎症性能和血小板聚集性能,而源自EPA的那些类花生酸类具有抗炎性能和抗血小板聚集性能。ARA可以从一些食物如肉、鱼和蛋类获得,但是其浓度低。γ-亚麻酸(GLA)是哺乳动物中存在的另一种必需脂肪酸。GLA是极长链n-6脂肪酸和多种活性分子的代谢中间体。在哺乳动物中,长链多不饱和脂肪酸的形成受Δ6去饱和作用限速。许多生理学和病理学状况如老化、应激、糖尿病、湿疹和一些感染已经显示抑制Δ6去饱和步骤。此外,GLA因氧化和与某些疾病(例如癌症或炎症)相关的快速细胞而易于分解代谢。因此,膳食补充GLA可以降低这些疾病的风险。临床研究已经显示,膳食补充GLA在治疗一些病理学疾病如特应性湿疹、经前综合征、糖尿病、高胆固醇血症、炎性疾病和心血管疾病方面是有效的。对于DHA或对于EPA/DHA的混合物,已经显示非常多的有益健康效果。DHA是一种具有6个双键的n-3极长链脂肪酸。虽然生物技术为生产特色的脂肪酸提供了有吸引力的途径,但是现有技术不能提供用于大规模生产不饱和脂肪酸的高效手段。因此,需要产生不饱和脂肪酸如DHA、EPA和ARA的改进和高效方法。因而,本发明涉及多核苷酸,其包含a)编码具有去饱和酶或延伸酶活性的多肽的至少一个核酸序列;b)与所述核酸序列有效连接的至少一个种子特异性和/或种子偏好性植物启动子;c)与所述核酸序列有效连接的至少一个终止子序列,和d)与所述启动子功能性连接并且与所述启动子和与a)中定义的所述多肽为异源的一个或多个增强核酸表达的核酸(NEENA)分子。在一个实施方案中,如根据本发明使用的术语“多核苷酸”涉及包含核酸序列的多核苷酸,其中所述核酸序列编码具有去饱和酶或延伸酶活性的多肽。优选地,由本发明多核苷酸编码的在植物中表达后具有去饱和酶或延伸酶活性的多肽应当能够增加例如种子油或整个植物或其部分中PUFA并且尤其LCPUFA的量。与产生LCPUFA的转基因对照植物相比时,这种增加优选地是统计显著的,其中所述转基因对照植物表达现有技术状态的为LCPUFA合成所需要的成套去饱和酶和延伸酶,但是不表达本发明的多核苷酸。可以通过本领域熟知的统计检验法(包括例如Studentt-检验),确定一种增加是否具有显著性。更优选地,所述增加是与所述对照相比,含有LCPUFA的三酯的量增加至少5%、至少10%、至少15%、至少20%或至少30%。优选地,之前所指的LCPUFA是具有C-20或C-22脂肪酸主体(body)的多不饱和脂肪酸、更优选地是ARA、EPA或DHA。在后续的实施例中描述用于测量之前提到的活性的合适测定法。如本文所用的术语“去饱和酶”或“延伸酶”指导入双键至脂肪酸碳链中、优选地至具有18、20或22碳脂肪酸分子中的去饱和酶或导入二碳分子至脂肪酸碳链中、优选地至具有18、20或22碳脂肪酸分子中的延伸酶的活性。优选的多核苷酸是这些多核苷酸,它们具有如SEQIDNOs:95、96、97、98、99、100或101中所示的核酸序列,编码显示去饱和酶或延伸酶活性的多肽(见表3)。其他优选的多核苷酸是这些多核苷酸,它们具有如SEQIDNOs:102或103中所示的核酸序列,编码显示去饱和酶或延伸酶活性的多肽(还见表4),其中除表3中所列的多核苷酸之外,所述多核苷酸尤其还用于22:6n-3(DHA)的合。

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